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Una vez concluida la síntesis en fase sólida los péptidos son sometidos al subsiguiente proceso de Clivaje, Extracción y Liofilización. Los péptidos liofilizados se caracterizan por cromatografía analítica RP-HPLC y Espectrometría de Masas MALDI-TOF.
Los cromatogramas de los péptidos sintetizados muestran una especie mayoritaria correspondiente al producto esperado y los espectros de masas indican la obtención del peso molecular esperado para cada uno de los péptidos sintetizados.
Los péptidos dendriméricos se sintetizaran siguiendo protocolos GMP para síntesis controlada de péptidos mediante la estrategia Boc-Bzl "neutralización in situ" y Fmoc. Las ramificaciones de los péptidos son secuencias cortas originadas a partir de la secuencia principal del péptido, por la inserción espaciada de residuos de lisina en diferentes posiciones de dicha secuencia.
Los aminoácidos (Boc Lys [Fmoc], Fmoc Lys [Boc] y Fmoc Lys [Fmoc]) se encuentran protegidos tanto por el extremo amino terminal como por la cadena lateral de donde emergen los brazos. Se analizaron por cromatografía RP-HPLC y Espectrometría de Masas EM MALDI-TOF.
Para lograr el segundo objetivo, se planteada de diseñar y sintetizar péptidos dendriméricos complejos con un número de residuos mayor a 25 amino ácidos.Para el desarrollo del Objetivo 3 (Vacunología), la metodología a desarrollar es la siguiente: Los estudios in-vivo de inmunogenicidad y de protectividad del
péptido en el mono de Aotus spp, se lleva a cabo usando las moléculas sintéticas formuladas en adyuvante de Freund como Gold Standard en la selección de las moléculas candidatas (no para uso en humanos).
Es claro que la capacidad antigénica, inmunogénica y alergogénica (neuromodulación) es dependiente del modelo, especie/cepa y del producto (péptido/adyuvante) a utilizar.
De estos estudios depende la selección adecuada de las moléculas candidatas para evitar entre otros, pecado inmunológico, autoanticuerpos y otros tipos de respuestas inmunomoduladas.
Desde el punto de vista de los adyuvantes, existen potenciales limitaciones en la formulación (compatibilidad de péptido/adyuvante, solubilidad, etc.), la seguridad (reactogenicidad) y los niveles de la inmunogenicidad. A esto se agrega que su disponibilidad depende de multinacionales.
Nuestro plan es evaluar diferentes moléculas de acuerdo a sus características biológicas y fisicoquímicas; microencapsulando el antigeno y utilizando como modelo experimental el modelo murino y Aotus.
Para el modelo Aotus nuestro grupo ya ha definido y estandarizado las pruebas inmunológicas y se ha determinado las características de respuesta inmune, con el propósito de proyectarlas al humano.
Se realizaran estudios paralelos pero independientes para evaluar dos secuencias derivadas de proteínas de P. falciparum.
Se probará su inmunogenicidad y eficacia en el modelo Aotus.
Se utilizaran péptidos que ya pasaron esta fase y por ende son de interés biológico, para probar su toxicidad en el modelo murino ICR al igual que en la cepa Balb/C para analizar su inmunogenicidad (formulados mediante microencapsulación en microesferas elaboradas con polímeros biodegradables).
De esta forma se va organizando el Master file final de los péptidos sintéticos a seleccionar como candidatos a vacuna. |
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